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組培生產的要點

文章作者:騰昊科技 發布時間:2021-09-23 11:20:01 瀏覽次數:850
培養基的配制
母液的配制和保存
      在植物組織培養過程中,配制培養基是日常必備工作。為減少工作量,經常使用的培養基,可先將各種藥品配成濃縮一定倍數的母液,放入冰箱內保存,用時再按比例稀釋,這樣操作比較方便,且精確度高。母液要根據藥劑的化學性質分別配制,一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質等母液。
      在配制大量元素母液時,要防止在混合各種鹽類時產生沉淀,為此各種藥品必須在充分溶解后才能混合。在混合時要注意加入的先后順序,把Ca2+、Mn2+、Ba2+、SO42-、PO43-錯開,以免KH2PO4和MgSO4與CaCl2等發生化學反應,相互結合生成CaSO4、BaSO4、Ca3(PO4)2沉淀。另外在混合各種無機鹽時,其稀釋度要大,慢慢混合,同時邊混合邊攪拌。在配制微量元素母液時也要注意藥品的添加順序,以免產生沉淀。

      鐵鹽容易發生沉淀,需要單獨配制。一般用FeSO4·7H2O和Na2-EDTA配成鐵鹽螯合劑比較穩定,不易沉淀,鐵鹽放在棕色瓶中保存比較穩定。
      母液要用蒸餾水配制,藥品應選用純度較高的化學純CP或分析純AR,以免有雜質對培養物造成不利影響。藥品的稱量及定容都要準確,稱量不同的化學藥品需使用不同的藥勺,避免藥品的交叉污染和混雜。每稱好一種藥劑應立即作一記號,以免重復或遺漏。各種藥品先用少量水讓其充分溶解,然后依次混合。
      配制好的母液應分別貼上標簽,注明母液種類、倍數、配制時間,并在記錄本上詳細記載配制及稱取量,以便工作的準確及日后檢查。母液最好在2-4℃的冰箱中保存,特別是有機物質要求更嚴,儲存時間不宜過長,如發現母液有霉菌污染或沉淀變質時,應重新配制。


      多數植物生長調節劑不溶于水或難溶于水,IAA、NAA、IBA、2,4-D等生長素類和GA3,可先用少量0.1molNaOH或95%酒精溶解,然后再用蒸餾水定容到所需要的體積。KT、6-BA等細胞分裂素類則可用少量1mol/L HCl加熱溶解,然后加水定容。植物生長調節劑母液可以在2-4℃的冰箱中保存。配制好的植物生長調節劑母液,也應在瓶上貼上標簽,注明名稱、濃度、配制日期,以便配制培養基時計算,準確量取。
培養基的制取
      將配制好的各種母液按順序排列,并逐一檢查是否有沉淀或變色,避免使用已失效的母液。先取適量的蒸餾水放入容器內,然后依次用移液管按培養基配方要求量吸取預先配制好的各種母液及生長調節劑,并混合在一起。再將瓊脂粉和糖加入其中,溶解混勻后加蒸餾水定容至所需體積。用0.1mol/L NaOH或HCl將培養基的pH值調至所需的數值,然后分裝到培養容器中。根據材料的不同,裝入培養基的量稍有差別,一般培養裝入0.7~1.2cm高度,讓培養材料能保持原有的狀態即可,最后包扎好瓶口或蓋上瓶蓋;并對不同配方的培養基要做好標記,以免混淆。



      培養基的pH值是影響植物組織培養成功的因素之一。不同種類的植物,其生長發育適宜的pH值也不同,應該根據所培養的植物特性來確定pH值,多數植物要求滅菌前培養基的pH值調節到5.7~5.8。經高溫高壓滅菌后,培養基的pH值會下降0.2~0.8個單位,故滅菌前的pH值要高于目標pH值0.5個單位。


植物組培中材料培養的條件
      接種后的外植體應轉移到培養室進行培養,培養條件要根據植物對環境條件的不同需求進行調控。培養室控制的條件主要有溫度、光照、濕度和氣體。


溫度
       溫度是植物組織培養中的重要因素,在適宜的溫度下植物才能良好的生長、分化。多數植物適宜生長溫度是在20~30℃,低于15℃時生長停止,高于35℃會抑制正常生長和發育。一個培養室內往往培養著許多種植物,為適合大多數植物生長,培養室的溫度一般設定在(25±2)℃。
       因為植物在自然界中長期進化,所以不同的植物對環境溫度的要求各有差別。一般生長在高寒地區的植物,其最適生長溫度較低;而生長在熱帶地區的植物,則對環境溫度相對要求較高。如馬鈴薯在20℃情況下培養效果較好,菠蘿在28-30℃情況下培養效果較好。在條件允許的情況下,可設立多個小培養室,根據不同植物對環境溫度的要求來設定培養室溫度。同時,也可根據培養室內上下層架的溫差來調節,一般培養室內最上層與最下層的溫差為2-3℃。



光照

      光是植物進行光合作用必不可少的條件之一,對離體培養物的生長發育具有重要的作用。光照的影響主要表現在光照強度、光照時間和光質三個方面。
(1)光照強度
      對多數植物來說,1000~4000ulx的光強即能滿足其生長的需要。器官的分化需要光照,并隨著試管苗的生長,光照強度需要不斷地加強,才能使小苗生長健壯,并促進它從“異養”向“自養”轉化,以提高移植后的成活率。通常在初代培養和繼代培養階段,1000~2500lux即可滿足要求。而對于生根壯苗階段,宜提高到3000~3500lux甚至10000lux。光照強度強,幼苗生長得粗壯,而光照強度弱,幼苗容易徒長。
       對愈傷組織的誘導來說,暗培養比光培養更合適,可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍,或置于暗室中培養。另外,在有些植物組織培養中,光的存在有時會抑制根的形成,這時可以在培養基中加入活性炭,提高根的形成率。


 
(2)光照時間
普通培養室要求每日光照12~16h。生產中,在不影響材料正常生長的條件下,盡量縮短光照時間,減少能源消耗,降低生產成本。在進行葡萄莖段培養時,對日照敏感的品種只有在短日照條件下才能形成根,而對日照長度不敏感的品種在任何條件下培養均可以形成根。
(3)光質
光質對細胞分裂和器官分化也有很大影響。如在香石竹的培養中,藍光有利于誘導側芽產生,還有利于蛋白質含量的增加;紅光可以促進芽增長,并且生長整齊。白光有利于試管苗的生長發育,生物產量最高;紅光次之;藍光促進提高莖葉中的還原糖含量,但對總糖的影響不大;白光還能增加葉綠素的合成。在唐菖蒲的子球切塊培養中,在藍光下出苗比在白光和紅光下早,且幼苗生長旺盛,根系粗壯;白光下幼苗纖細;紅光下出苗量少。而紅光對百合和四季豆愈傷組織的誘導和生長比在白光下好。光質對植物組織分化的影響,目前尚無一定規律可循,這可能是不同植物對光信號反應不同所致。但如果能把這些光質的作用,有意識地運用到種苗的規?;a中,可達到節省能源,提高產量的目的。



濕度
組織培養中的濕度影響主要有培養容器內濕度和培養環境濕度兩方面。
       容器內的濕度可保持在100%,之后隨著培養時間的推移,相對濕度也會有所下降。容器內的濕度主要受瓊脂含量和封口材料的影響。在冬季應適當減少瓊脂用量,否則,將使培養基干硬,不利于外植物體接觸或插進培養基,導致生長發育受阻。在培養容器封口材料選擇上應十分注意,所選擇的封口材料至少要保證在一個月內有充足水分來滿足外植體的需要。如果培養容器內水分散失過多,培養基滲透壓升高,會阻礙培養物的生長和分化。當然,封口材料過于密閉,影響氣體交流,導致有害氣體難于散去,也會影響培養物的生長和分化。
       環境濕度變化隨季節和大氣而有很大變動。濕度過高或過低對培養材料的生長都是不利的,過低會造成培養基失去而干枯,影響培養物的生長和分化;濕度過高會造成雜菌滋生,導致大量污染。培養室的相對濕度一般要保持在70%~80%,濕度過高時可用除濕機降濕,過低時可采用加濕機加濕、噴水或拖地來增濕。
氣體環境
植物組織培養中,植物的呼吸需要氧氣。在液體培養中,需進行振蕩和旋轉或淺層培養以解決氧氣供應。在固體培養中,接種時不要把培養物全部埋入培養基中,以避免氧氣不足,剛剛切割后的外植體會產生乙烯,造成材料的老化,從而影響生長和分化。另外,培養物產生二氧化碳,當濃度過高時,會阻礙培養物的生長和分化。因此要注意瓶內與外界保持通氣狀態,最好采用通氣性好的瓶蓋、有濾氣膜的封口材料或棉塞。培養室要適當通風換氣,改善室內的通氣狀況,每次通風后要進行一次消毒,避免引起培養污染。

一個完整的植物組織培養過程包括的步驟:

準備階段
查閱相關文獻,根據已成功培養的相近植物資料,結合實際制訂出切實可行的培養方案。然后根據實驗方案配制適當的化學消毒劑以及不同培養階段所需的培養基,并經高壓滅菌或過濾除菌后備用。
外植體選擇與消毒
      選擇合適的部位作為外植體,采回后經過適當的預處理,然后進行消毒處理。將消毒后的外植體在無菌條件下切割成一定大小的小塊,或剝離出莖尖,挑出花藥,接種到初代培養基上。



初代培養
      接種后的材料置于培養室或光照培養箱中培養,促使外植體中已分化的細胞脫分化形成愈傷組織,或頂芽、腋芽直接萌發形成芽。然后將愈傷組織轉移到分化培養基分化成不同的器官原基或形成胚狀體,最后發育形成再生植株。
繼代培養
      分化形成的芽、原球莖數量有限,采用適當的繼代培養基經多次切割轉接。當芽苗繁殖到一定數量后,再將一部分用于壯苗生根,另一部分保存或繼續擴繁。進行脫毒苗培養的需提前進行病毒檢測。


生根培養

       剛形成的芽苗往往比較弱小,多數無根,此時可降低細胞分裂素濃度或不添加,提高生長素濃度,促進小苗生根,提高其健壯度。


煉苗移栽

       選擇生長健壯的生根苗進行室外煉苗,待苗適應外部環境后,再移栽到疏松透氣的基質中,注意保溫、保濕、遮蔭,防止病蟲危害。當組培苗完全成活并生長一定大小后,即可移向大田用于生產。




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